书 书 书犐犆犛 ６５ ． ０２０ ． ３０ 犅 ４４ 中华人民共和国国家标准 犌犅 ／ 犜 １４９２６ ． １０ — ２００８ 代替 ＧＢ ／ Ｔ１４９２６．１０ — ２００１ 实验动物 　 泰泽病原体检测方法 犔犪犫狅狉犪狋狅狉狔犪狀犻犿犪犾 — 犕犲狋犺狅犱犳狅狉犲狓犪犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳犜狔狕狕犲狉 ’ 狊狅狉犵犪狀犻狊犿 ２００８  １２  ０３ 发布 ２００９  ０３  ０１ 实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会 发布书 书 书前 　　 言 　　 ＧＢ ／ Ｔ１４９２６ 《 实验动物 》 共 ５４ 个部分 ， 为不同微生物和病毒检测技术方法 。 本部分自实施之日起代替 ＧＢ ／ Ｔ１４９２６．１０ — ２００１ 《 实验动物 　 泰泽病原体检测方法 》。 本部分与 ＧＢ ／ Ｔ１４９２６．１０ — ２００１ 相比主要技术差异如下 ： ａ ） 　 删除了可的松激发试验 ； ｂ ） 　 修改了两种血清学方法 。 本部分由全国实验动物标准化技术委员会提出并归口 。 本部分起草单位 ： 全国实验动物标准化技术委员会 。 本部分主要起草人 ： 李红 。 本部分所代替标准的历次版本发布情况为 ： ——— ＧＢ ／ Ｔ１４９２６．１０ — １９９４ ， ＧＢ ／ Ｔ１４９２６．１０ — ２００１ 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 １４９２６ ． １０ — ２００８ 实验动物 　 泰泽病原体检测方法 １ 　 范围 ＧＢ ／ Ｔ１４９２６ 的本部分规定了实验动物泰泽病原体的检测方法 。 本部分适用于小鼠 、 大鼠 、 豚鼠 、 地鼠和兔泰泽病原体的检测 。 ２ 　 规范性引用文件 下列文件中的条款通过 ＧＢ ／ Ｔ１４９２６ 的本部分的引用而成为本部分的条款 。 凡是注日期的引用文 件 ， 其随后所有的修改单 （ 不包括勘误的内容 ） 或修订版均不适用于本部分 ， 然而 ， 鼓励根据本部分达成 协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本 。 凡是不注日期的引用文件 ， 其最新版本适用于本 部分 。 ＧＢ ／ Ｔ１４９２６．５０ 　 实验动物 　 酶联免疫吸附试验 ＧＢ ／ Ｔ１４９２６．５２ 　 实验动物 　 免疫荧光试验 ３ 　 原理 动物感染泰泽病原体后血清中可产生相应的抗体 。 依据免疫学原理 ， 采用泰泽病原体抗原检测小 鼠 、 大鼠 、 豚鼠 、 地鼠和兔血清中相应的抗体 。 ４ 　 主要设备和材料 ４ ． １ 　 普通恒温培养箱 。 ４ ． ２ 　 荧光显微镜 。 ４ ． ３ 　 生物显微镜 。 ４ ． ４ 　 酶标仪 。 ４ ． ５ 　 组织研磨器 。 ４ ． ６ 　 聚苯乙烯板 ， ４０ 孔 、 ５５ 孔或 ９６ 孔 （ 可拆或不可拆 ）， 用前洗净晾干 ， 紫外光照射 １ｈ 。 ４ ． ７ 　 微量加样器 ， 容量 ５ μ Ｌ ～ ５０ μ Ｌ 、 ５０ μ Ｌ ～ ２００ μ Ｌ 。 ４ ． ８ 　 印有 １０ 个 ～ ４０ 个小孔的载玻片 。 ４ ． ９ 　 盖玻片 。 ４ ． １０ 　 超低温冰箱或液氮罐 。 ５ 　 培养基和试剂 ５ ． １ 　 ＥＬＩＳＡ 抗原 ５ ． １ ． １ 　 泰泽病原体抗原 受泰泽病原体感染的 、 带有严重坏死灶的动物肝脏按 １∶１０ 加入 ＰＢＳ 后在冰浴中用组织研磨器制 成匀浆 ， ３６００ｒ ／ ｍｉｎ 离心 ， 取上清液作抗原 。 ５ ． １ ． ２ 　 阴性对照抗原 未受泰泽病原体感染的动物肝脏 ， 按 ５．１．１ 的方法制成 。 ５ ． ２ 　 抗原片 ５ ． ２ ． １ 　 抗原 受泰泽病原体感染的 、 带有严重坏死灶的动物肝组织用 ＰＢＳ 按 １∶１０ 在冰浴中制成匀浆 ， 调整浓 １ 犌犅 ／ 犜 １４９２６ ． １０ — ２００８ 度至每个显微镜油镜视野有适当的菌量 ， 即细菌 、 肝细胞 、 细胞碎片完全铺开 ， 不重叠 。 泰泽病原体自溶 现象严重 ， 应尽快完成该过程 。 ５ ． ２ ． ２ 　 抗原片制备 将上述抗原液适量滴于玻片孔中 ， 室温干燥后 ， 冷丙酮 （ ４℃ ） 固定 １０ｍｉｎ 。 ＰＢＳ 漂洗后充分干燥 ， 置于 －２０℃ 备用 。 ５ ． ３ 　 酶结合物 辣根过氧化物酶标记的羊或兔抗小鼠 、 大鼠 、 豚鼠 、 地鼠 ＩｇＧ 抗体 ， 用于检测相应动物的抗体 ； 辣根 过氧化物酶标记的羊抗兔 ＩｇＧ 抗体 ， 用于检测兔血清抗体 ； 辣根过氧化物酶标记的葡萄球菌蛋白 Ａ （ ＳＰＡ ）， 用于检测大鼠血清以外的动物血清抗体 。 ５ ． ４ 　 荧光结合物 荧光标记的羊或兔抗小鼠 、 大鼠 、 豚鼠 、 地鼠 ＩｇＧ 抗体用于检测相应动物的血清抗体 ； 荧光标记的 羊抗兔 ＩｇＧ 抗体 ， 用于检测兔血清抗体 。 ５ ． ５ 　 阳性血清 上述抗原免疫清洁级或 ＳＰＦ 级小鼠 、 大鼠 、 豚鼠 、 地鼠或无泰泽病原体感染的兔获得的抗血清 。 ５ ． ６ 　 阴性血清 清洁级或 ＳＰＦ 级小鼠 、 大鼠 、 豚鼠 、 地鼠血清 ； 或无泰泽病原体感染的兔血清 。 ５ ． ７ 　 ５０％ 甘油 ＰＢＳ 。 ５ ． ８ 　 其他试剂溶液的配制见 ＧＢ ／ Ｔ１４９２６．５０ 和 ＧＢ ／ Ｔ１４９２６．５２ 。 ６ 　 检测方法 ６ ． １ 　 酶联免疫吸附试验 （ 犈犔犐犛犃 ） ６ ． １ ． １ 　 包被抗原 根据滴定的最适工作浓度 ， 将两种抗原分别用包被液稀释 ， 两种抗原隔行包被 ， 每孔包被抗原 １００ μ Ｌ ， 置 ３７℃１ｈ 后在 ４℃ 过夜 。 ６ ． １ ． ２ 　 用洗涤液洗 ３ 次 ， 每次 ５ｍｉｎ ， 叩干 。 ６ ． １ ． ３ 　 加样 待检血清用稀释液做 １∶４０ 稀释 ， 分别加入两孔 （ 泰泽病原体抗原孔和阴性对照抗原孔 ）， 每一抗原 板至少设置两份阳性血清和阴性血清对照 。 每孔加入稀释后的待检血清 、 对照血清 １００ μ Ｌ ， ３７℃１ｈ ， 洗涤同上 。 ６ ． １ ． ４ 　 加酶结合物 用稀释液将酶结合物稀释成适当浓度 ， 每孔 １００ μ Ｌ ， ３７℃１ｈ ， 洗涤同上 。 ６ ． １ ． ５ 　 加底物溶液 每孔加入新配制的底物溶液 １００ μ Ｌ ， 置 ３７℃ ， 避光显色 １０ｍｉｎ ～ １５ｍｉｎ 。 ６ ． １ ． ６ 　 终止反应 每孔加入终止液 １００ μ Ｌ 。 ６ ． １ ． ７ 　 测 犃 值 在酶标仪上 ， 于 ４９０ｎｍ 处读出各孔 犃 值 。 ６ ． １ ． ８ 　 结果判定 在阴性和阳性对照成立的情况下 ， 进行结果判定 。 ６ ． １ ． ８ ． １ 　 同时符合下列 ３ 个条件者 ， 判为阳性 。 对阳性结果需重试 ， 如仍为阳性则判为阳性 ： ａ ） 　 待检血清与阴性对照抗原和泰泽病原体抗原反应有明显的颜色区别 ； ｂ ） 　 待检血清与泰泽病原体抗原反应的 犃 值大于等于 ０．２ ； ｃ ） 　 待检血清与泰泽病原体抗原反应的 犃 值 ／ 阴性对照血清与泰泽病原体抗原反应的 犃 值大于等 于 ２．１ 。 ２ 犌犅 ／ 犜 １４９２６ ． １０ — ２００８ ６ ． １ ． ８ ． ２ 　 均不符合上述 ３ 个条件者 ， 判为阴性 。 ６ ． １ ． ８ ． ３ 　 仅有 １ 条 ～ ２ 条符合者 ， 判为可疑 ， 需重试 。 ６ ． ２ 　 免疫荧光试验 （ 犐犉犃 ） ６ ． ２ ． １ 　 取出抗原片 ， 室温干燥后 ， 将适当稀释的待检血清 （ 推荐 １∶１０ ） 和阴性 、 阳性血清分别滴于抗原 片上 ， 每张玻片上应分别有阳性和阴性血清各 １ 孔 ， 置湿盒内 ， ３７℃３０ｍｉｎ ～ ４５ｍｉｎ 。 ６ ． ２ ． ２ 　 ＰＢＳ 洗 ３ 次 ， 每次 ５ｍｉｎ ， 室温干燥 。 ６ ． ２ ． ３ 　 取适当的荧光结合物 ， 滴加于抗原片上 ， 置湿盒内 ， ３７℃３０ｍｉｎ ～ ４５ｍｉｎ 。 ６ ． ２ ． ４ 　 ＰＢＳ 洗 ３ 次 ， 每次 ５ｍｉｎ 。 ６ ． ２ ． ５ 　 玻片用蒸馏水漂洗 １ 次 。 ６ ． ２ ． ６ 　 ５０％ 甘油 ＰＢＳ 封片 ， 荧光显微镜下观察结果 。 ６ ． ２ ． ７ 　 结果判定 ： 阳性血清孔菌体呈强的荧光着色 ， 而阴性对照无荧光或仅有微弱非特异荧光时进行 结果判定 。 待检血清孔较阴性血清孔菌体荧光着色强 ， 即可判断为阳性反应 。 ７ 　 结果报告 对血清抗体阳性者作血清抗体检测阳性报告 ， 否则作阴性报告 。 犌犅 ／ 犜 １４９２６ ． １０ — ２００８ 书 书 书 ８００２ — ０１  ６２９４１ 犜 ／ 犅犌 中华人民共和国 国家标准 实验动物 　 泰泽病原体检测方法 ＧＢ ／ Ｔ１４９２６．１０ — ２００８  中国标准出版社出版发行 北京复兴门外三里河北街 １６ 号 邮政编码 ： １０００４５ 网址 ｗｗｗ．ｓｐｃ．ｎｅｔ．ｃｎ 电话 ： ６８５２３９４６ 　 ６８５１７５４８ 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷 各地新华书店经销  开本 ８８０×１２３０１ ／ １６ 　 印张 ０．５ 　 字数 ６ 千字 ２００９ 年 ２ 月第一版 　 ２００９ 年 ２ 月第一次印刷  书号 ： １５５０６６ · １３５７６５ 如有印装差错 　 由本社发行中心调换 版权专有 　 侵权必究 举报电话 ：（ ０１０ ） ６８５３３５３３