ICS 65.020.01 CCS B 04 团 体 标 准 T / N A I A 0 2 6 —2 0 2 1T/ NAIA 0206-2023 食用菌中游离氨基酸的测定 液相色谱-质谱联用法 Determination of free amino acids in edible fungi Liquid chromatography-tandem mass spectrometry method 2023-04-28发布 2023-05-01实施 宁夏化学分析测试协会 发 布 发布TB 全国团体标准信息平台 全国团体标准信息平台 前 言 本文件按照 GB/T 1.1-2020 《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规 则》的规定起草。 本文件由宁夏化学分析测试协会提出并归口。 本文件起草单位：宁夏农产品质量标准与检测技术研究所 、宁夏农林科学院园艺研究所 。 本文件主要起草人 ：赵子丹、牛艳、王晓静、开建荣、李冬、王晓菁、陈翔、闫玥、王 海霞、吴燕、石欣、王彩艳、刘霞、杨静、张锋锋。 本文件为首次发布。 全国团体标准信息平台 食用菌中游离氨基酸的测定 液相色谱 -质谱联用法 1 范围 本文件规定了香菇、羊肚菌等食用菌中游离氨基酸含量的高效液相色谱 -质谱联用测定 方法。 本文件适用于香菇、羊肚菌等 食用菌中 20种游离氨基酸（蛋氨酸、甘氨酸、缬氨酸、 色氨酸、组氨酸、丝氨酸、亮氨酸、异亮氨酸 、苯丙氨酸 、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨 酸、天冬氨酸、天冬酰胺、精氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、γ -氨基丁酸）的测定。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款 。其中，注日期 的引用文件， 仅该日期对应的版本适用本文件 ；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所 有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法。 3 术语和定义 无。 4 原理 试样经甲醇溶液超声提取，通过液相色谱 -质谱联用仪检测 ，外标法定量。 5 试剂与材料 除非另有规定外，所有试剂均为分析纯，水符合 GB/T 6682中规定的一级水。 5.1 甲醇（ CH 4O）：色谱纯。 5.2 乙腈（ CH 3CN）：色谱纯。 5.3 甲酸（ CH 2O2）：色谱纯。 5.4 50%甲醇溶液（ 50+50，体积比）： 量取 50 mL水加入 50 mL甲醇中，混匀。 5.5 0.1%甲酸溶液（体积分数）。 5.6 氨基酸标准品： 蛋氨酸 Met（CAS号63-68-3）、甘氨酸 Gly（CAS号56-40-6）、缬 氨酸 Val（CAS号72-18-4）、色氨酸 Trp（CAS号73-22-3）、组氨酸 His（CAS号 全国团体标准信息平台 71-00-1）、丝氨酸 Ser（CAS号56-45-1）、亮氨酸 Leu（CAS号61-90-5）、异亮氨酸 Ile （CAS号73-32-5）、苯丙氨酸 Phe（CAS号63-91-2）、苏氨酸 Thr（CAS号72-19-5）、 丙氨酸 Ala（CAS号56-41-7）、脯氨酸 Pro（CAS号147-85-3 ）、酪氨酸 Tyr（CAS号 60-18-4）、天冬氨酸 Asp（CAS号56-84-8）、天冬酰胺 Asn（CAS号70-47-3）、精氨酸 Arg （CAS号74-79-3）、赖氨酸 Lys（CAS号56-87-1）、谷氨酰胺 Gln（CAS号56-85-9）、 谷氨酸 Glu（CAS号56-86-0）、γ-氨基丁酸（CAS号56-12-2），20种氨基酸浓度均为 1000 mg/L。 5.7 标准溶液配制：分别准确 移取 0.1mL的氨基酸标准溶液，用甲醇溶液（ 5.4）溶解，分 别配制成 10 mg/L的标准中间溶液， -18 ℃下保存。 6 仪器与设备 6.1 高效液相色谱 -质谱联用仪：配有电喷雾离子源（ ESI）。 6.2 分析天平： 感量 0.01 g，0.0001g。 6.3 组织捣碎机。 6.4 高速粉碎机： 10000 r/min。 6.5 高速分散机。 6.6 离心机： 4000 r/min。 6.7 涡旋混合器。 6.8 滤膜： 0.22 μm，有机相。 7 分析步骤 7.1 试样的制备 新鲜的食用菌子实体样品 ，用破壁料理机打浆 ，干样用高速粉碎机粉碎 ，分别置于样品 盒(袋)中， -18℃冷冻备用。 7.2 样品提取 7.2.1鲜样 称取试样 1.00 g（精确至 0.0001 g）于50 mL离心管， 加入 40.0 mL甲醇溶液 (5.4)，经 超声提取 30 min，于4000r/min 离心 5min后，吸取 2.00 mL上清液过 0.22 μm滤膜，待测定。 7.2.2干样 称取试样 0.02 g（精确至 0.0001 g）于50 mL离心管， 加入 40.0 mL甲醇溶液 (5.4)，经 超声提取 30 min，于4000r/min 离心 5min后，吸取 2.00 mL上清液过 0.22 μm滤膜，待测定。 7.3 测定 7.3.1 液相色谱参考条件 全国团体标准信息平台 a）色谱柱： C18柱， 3.5 mm（内径） ×150 mm，粒径 4.6 μm，或相当者； b）流动相： A相为甲酸溶液（ 5.5）， B相为乙腈 ，流动相 梯度条件见表 1； c）流速： 0.3 mL/min； d）柱温： 40 ℃； e）进样量： 2 μL。 表1 流动相及其梯度条件（ VA+VB） 时间 min VA % VB % 0.00 98 2 2.0 98 2 14.0 2 98 15.0 2 98 15.1 98 2 18.0 98 2 7.3.2 质谱参考条件 a）离子源类型：电喷雾离子源； b）扫描方式： 正离子扫描； c）电喷雾电压： 5500 V； d）离子源温度： 550 ℃； e）喷雾气流速： 55 L/h； f）气帘气流速： 55 L/h； g）多反应监测： 20种氨基酸的保留时间、母离子、子离子及离子对质谱参数见表 2。 表2 20种氨基酸的多反应离子监测质谱参数 中文名称 英文简写 保留时间 min 定性离子对 m/z 定量离子对 m/z 去簇电压 V 碰撞能 V 谷氨酰胺 Gln 4.70 147.1/84.0 147.1/130.0 147.1/84.0 22 14 23 赖氨酸 Lys 4.71 147.1/84.1 147.1/130.0 147.1/84.1 22 14 24 组氨酸 His 4.78 156.1/110.1 156.1/82.9 158.0/102.1 35 20 32 精氨酸 Arg 4.81 175.2/70.0 175.2/60.0 175.2/70.0 45 29 18 甘氨酸 Gly 5.02 76.2/30.0 76.2/30.0 29 15 天冬酰胺 Asn 5.05 133.1/74.0 133.1/87.0 133.1/74.0 35 15 21 丝氨酸 Ser 5.05 106.1/60.0 106.1/70.0 106.1/60.0 22 14 15 天冬氨酸 Asp 5.11 133.9/88.0 133.9/74.3 133.9/88.0 35 14 18 丙氨酸 Ala 5.13 90.1/44.0 90.1/44.0 40 14 苏氨酸 Thr 5.17 120.1/74.1 120.1/56.0 120.1/74.1 25 14 20 全国团体标准信息平台 γ-氨基丁酸 GABA 5.18 87.0/104.1 69.0/104.1 87.0/104.1 30 15 25 谷氨酸 Glu 5.20 148.2/84.1 148.2/102.0 148.2/84.1 20 14 22 脯氨酸 Pro 5.52 116.1/70.0 116.1/70.0 31 20 缬氨酸 Val 6.15 118.1/72.2 118.1/55.1 118.1/72.2 55 15 28 蛋氨酸 Met 7.74 150.2/104.0 150.2/133.0 150.2/104.0 45 15 15 酪氨酸 Tyr 9.43 182.1/165.0 182.1/136.1 182.1/165.0 50 15 20 异亮氨酸 Ile 10.61 132.1/86.1 132.1/69.1 132.1/86.1 35 15 25 亮氨酸 Leu 10.73 132.1/86.1 132.1/86.1 25 15 苯丙氨酸 Phe 11.18 166.1/120.1 166.1/103.0 166.1/120.1 40